Erläuterung:

Unsere wissenschaftlichen Aufgaben umfassen die in vivo Bildgebung von Stammzellen und deren Differenzierung nach Interaktion mit der Zellumgebung (Stammzellnische) im Fisch (Medaka, Zebrabaerbling), während Entwicklung, Wachstums und Regeneration unter normalen Bedingungen und in Erkrankungen. Wir untersuchen die Bedeutung des lokalen Mikroenvironments der Stammzellen und deren Wechselwirkungen mit der Nische sowie Entwicklungsprozesse im lebenden Organismus im Zeitverlauf (Gastrulation in Fisch und Fliege). Hypothesen sollen mit FLIM-basierten Ansätzen im Hochdurchsatzverfahren (Fish/MIKK-Panel) getestet werden. Wir analysieren Zell-Zell Interaktionen und Dynamiken des Zellskeletts im wachsenden Fliegenembryo und nutzen, quantitative, gleichzeitige Erfassung multipler Komponenten in hoher Auflösung (Zeit/Raum). Gleichzeitig sollen Adhäsionsproteine während der Entwicklung verschiedener Fliegenarten durch intra-vs. inter-molekularem FRET als Maß für das Proteinclustering untersucht werden. Wir planen parallelisierte, multiplex in situ Experimente im Muskelgewebe der Fliege zur zellaufgelösten Charakterisierung der Genexpression.

Folgende zwingende Anforderungen haben sich Rahmen des Drittmittelantrages hieraus an das zu beschaffende System ergeben: Das Instrument muss die gleichzeitige Anwendung von Multi-Kanal 2-Photonen-Mikroskopie (für die Bildgebung tief im Gewebe) mit schnellen FLIM-Methoden ermöglichen sowie ein flexibles Detektionsfenster besitzen um für ein maximales Spektrum an Fluorophoren ("multiplex in situ hybridization", acht verschiedene Fluorophore simultan unter Ausblendung der Autofluoreszenzen).

Mit dem System müssen sehr schnell (Auflösung < 1min) und dateneffizient alle verfügbaren Informationen (Position in Raum und Zeit, Vielzahl verschiedener Fluorophore, Informationen zur Lebenszeit) erfasst werden (Fast FLIM) um die notwendigen Hochdurchsatzanalysen zu ermöglichen. Es sollen simultan mehrere Fluorophore auch im tiefen Gewebe (multi-photon) dynamisch dargestellt werden, teilweise simultan in mehreren Organen und mit multiplen, spektral überlappenden, fluoreszenten Reportern (FLIM) vor autofluoreszentem Hintergrund. Die Analyse von Autofluoreszenzen und dem zweiten harmonischen Signal zytoskeletaler Filamente tief im Gewebe sollte label-freie Bildgebung ermöglichen mit breitem Spektrum verfügbarer Kanäle für FLIM in Kombination mit genau abstimmbarerer Emission und Detektion.

Das benötigte Leica Stellaris Mikroskop in der geplanten Konfigurationist ist das einzige System auf dem Markt, welches die gestellten wissenschaftlichen Anforderungen vollständig erfuellt. Die Markerkundung fuehrte zum Ergebnis, dass keine Alternativen oder Ersatzlösungen existieren. Insofern besteht die Voraussetzung fuer eine Auftragsvergabe im Verhandlungsverfahren ohne Teilnahmewettbewerb gemäß § 14 Abs. 4 Nr. 2 b und c VgV.

Das Stellaris FALCON DIVE hat ein besonders schnelles FLIM System: FAst Lifetime CONtrast (FALCON)-System (Patent: EP 2 592 413 B1) das die Erfassung von Fluoreszenzlebenszeitdaten in 1:10 der Zeit herkömmlicher FLIM-Ansätze und den speziell für diesen Zweck entwickelten HyD X-Detektor (Patent: DE 10 2011 052 334 B4,) ermöglicht.

Die Besonderheit der Elektronik erlaubt die Aufzeichnung von 80 Mcps (10 mal so viel wie andere FLIM-Systeme, erhöhten Erfassungsgeschwindigkeit/gleichzeitige Erfassung mehrere Proteine mit stark unterschiedlicher Fluoreszenzintensität). Es bietet mit TauSense (Patent: EP 2 592 413 B1) eine auf Fluoreszenslebenszeit basierte Methode die auf einzigartig unkomplizierte Weise in normaler konfokaler Geschwindigkeit qualitative und semi-quantitative Informationen liefert und das schnelle Scannen im Hochdruchsatz die Datenmengen im Vergleich zu anderen FLIM Systemen handhabbar hält.

Mit dem DIVE 4Tune ermöglicht Leica als einziger Hersteller die spektralen Fenster für die Detektion von 2Photon-während des Experiments einzustellen ohne das ein Filterwechsel vonnöten ist.