Explication:

La capture d’objets en trois dimensions de type organoïde nécessite une section optique en profondeur que seul un microscope confocal, idéalement muni d’une source laser;

Un microscope confocal doit non seulement permettre d’améliorer la résolution spatiale (x, y) et axiale (z) de la capture d’un échantillon, mais doit aussi idéalement permettre la capture d’évènements à la cinétique rapide. Pour cette raison, le microscope confocal doit être muni de disques rotatifs (« spinning disk »), au minimum de deux types. La présence dans l’instrument de disques avec des trous (« pinholes ») de diamètres différents permet de déterminer pour chaque échantillon le bon compromis entre sensibilité et résolution.

Chaque objet capturé étant décrit à l’aide de multiples marquages fluorescents, une illumination adéquate, idéalement jusqu’à 7-8 marqueurs simultanés, doit être fournie.

Afin d’obtenir des données statistiquement pertinentes, l’automatisation de l’acquisition des échantillons est essentielle. Cette acquisition impose l’usage de plaques multi-puits (formats 96, 384 puits ; fonds plat ou rond) que le système doit pouvoir capturer précisément, à l’aide d’une platine motorisée et d’un système d’autofocus matériel et, éventuellement, logiciel.

La capture d’objets en trois dimensions, a fortiori lorsqu’il s’agit d’identifier des structures subcellulaires, requiert une résolution maximale. Un autre élément relatif à la qualité des images acquises – et donc de l’information que l’on peut en retirer – est le maintien de la morphologie/circularité des objets capturés alors que le signal fluorescent traverse des milieux (de culture, plastique de la plaque) aux indices de réfraction différent. Les objectifs à immersion à eau, qui proposent une résolution supérieure à leurs équivalents en grossissement à air ainsi qu’une meilleure conservation de la circularité des objets, seront donc nécessaires à l’exploitation de nos échantillons. Le microscope doit donc proposer une telle solution, comprenant objectifs et système à immersion à eau attenant.

Compte tenu de la variabilité des échantillons que nous souhaitons capturer, le microscope devra pouvoir accueillir des grossissements variés. Des objectifs 4X, 10X, 20X et 60X seront nécessaires. Les objectifs 20X et 60x, compte tenu du paragraphe précédent, devront être munis du système à immersion à eau.

L’analyse d’images pour des objets 2D et 3D permettant d’obtenir des informations statistiques est également nécessaire.

Le seul instrument du marché comprenant une illumination laser (7 lasers, 8 canaux), des objectifs à immersion à eau , un choix de plusieurs disques rotatifs avec des outils d’analyse 2D/3D tels que décrits ci-dessus est l’imageXPress HT-ai.